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Interactions médicamenteuses et transporteurs

Les transporteurs membranaires, situés dans de nombreux tissus barrières de l'organisme, peuvent interagir avec les médicaments pour en affecter l'absorption, la distribution et l'élimination in vivo, et sont la cause d'interactions médicamenteuses cliniquement pertinentes (IM). L'identification de l'article testé comme un substrat ou un inhibiteur de transporteurs peut expliquer les expositions modifiées et les toxicités cliniquement pertinentes des médicaments administrés de façon concomitante. La perméabilité intestinale d'un médicament est un facteur important qui détermine la fraction absorbée et peut être évaluée à l'aide du test de transport monocouche Caco-2.

Considérations réglementaires pour les interactions avec les transporteurs

Ces études sont recommandées par les directives de la FDA et de l'EMA sur les interactions médicamenteuses (IM) pour évaluer les interactions entre les transporteurs avant de passer aux premiers essais chez l'homme. Les études sur les transporteurs mettent en évidence les problèmes potentiels liés à l'obtention de concentrations plasmatiques efficaces des médicaments administrés en concomitance en raison de l'impact d'un médicament sur l'absorption ou la distribution.

Plusieurs transporteurs interagissent avec les médicaments dans l'utilisation clinique. Voici les tests recommandés :

  • Les transporteurs d'efflux ATP binding cassette (ABC) : la glycoprotéine P (P-gp), la protéine de résistance au cancer du sein (BCRP) et la pompe d'exportation de sel biliaire (BSEP).
  • Les transporteurs d'absorption de solutés (SLC), les transporteurs d'anions organiques OAT1 et OAT3, le transporteur de cations organiques (OCT) 2, les polypeptides de transport d'anions organiques, OATP1B1, OATP1B3, et les Multidrug and Toxin Extrusion (MATE) 1 et MATE2 K.

Méthodes pour les interactions avec les transporteurs

  • Système de test : des lignées cellulaires transfectées exprimant un transporteur à absorption unique (SLC) ou un vecteur de contrôle, cultivées en monocouche dans un incubateur humidifié à 37°C à 5 % de CO2.
  • Solution tampon : HBSS avec HEPES, pH 7,4
  • Pour les transporteurs MATE uniquement, les cellules sont prétraitées avec NH4Cl pour introduire un gradient de pH à travers la membrane cellulaire, nécessaire à l'activité d'absorption des MATE
  • Concentrations des articles testés : 2 pour les essais substrats et 2 pour les essais d'inhibition
  • Des substrats d'investigation radiomarqués spécifiques pour chaque transporteur
  • Des inhibiteurs de contrôle positifs pour chaque transporteur

Les cellules exprimant les transporteurs en culture sont préincubées avec une solution tampon pendant 30 minutes dans un incubateur humidifié à 37 °C dans 5 % de CO2. Les cellules qui expriment MATE sont traitées avec du NH4CI pour créer un gradient de pH à travers la membrane cellulaire afin de faciliter l'activité d'assimilation. Un substrat d'investigation ou article testé est ajouté pour multiplier les puits par trois et des inhibiteurs sont ajoutés le cas échéant. Les plaques sont incubées entre 2 et 10 minutes selon le transporteur. La solution tampon est aspirée ; et les cellules sont lavées, puis lysées, collectées et analysées pour détecter la présence de l'article testé à l'aide de la LC-MS.

Évaluation du substrat : l'absorption de l'article testé par chaque transporteur seul ou en présence d'un inhibiteur sélectif sera comparée à l'absorption par le vecteur témoin après une incubation de 2 à 5 minutes. L'absorption d'un substrat d'investigation par chaque transporteur seul ou en présence d'un inhibiteur sélectif et par le vecteur de contrôle sera effectuée comme contrôle.

Évaluation de l'inhibiteur : l'absorption d'un substrat d'investigation par chaque transporteur sera effectuée seule ou en présence d'un inhibiteur sélectif ou de l'article testé. L'absorption du substrat d'investigation par le vecteur contrôle sera également réalisé comme témoin. Si une inhibition est observée, le CI50 peut être déterminé.

  • Système test : cellules endothéliales intestinales humaines Caco-2, cultivées sur des plaques Transwell dans un incubateur humidifié à 37 °C dans 5 % de CO2 pendant 21 à 24 jours
  • Solution tampon : HBSS avec HEPES, pH 7,4 dans des chambres apicales et basolatérales
  • La résistance trans-endothéliale électrique (TEER) est mesurée avant l'essai pour confirmer la formation d'associations étroites
  • Concentrations des articles testés : 2 pour les essais substrats et 2 pour les essais d'inhibition
  • Des marqueurs de perméabilité radiomarqués, le mannitol et la caféine sont utilisés pour vérifier la formation d'associations étroites
  • Des substrats d'investigation radiomarqués sont utilisés, spécifiques à chaque transporteur
  • Des inhibiteurs sélectifs de contrôle positif pour chaque transporteur avec des contrôles d'inhibiteurs négatifs

L'apparente perméabilité de l'article testé et des substrats d'investigation est déterminée à la fois dans le sens apical à basolatéral (A-B) et dans le sens basolatéral à apical (B-A) sur des plaques Transwell. Après 30 minutes de préincubation dans une solution tampon dans un incubateur humidifié à 37 °C dans 5 % de CO2, l'article de test ou d'investigation est ajouté dans une chambre (donneur) avec un tampon blanc dans la chambre opposée (récepteur). Les inhibiteurs sont ensuite ajoutés dans les deux chambres, le cas échéant. Les plaques sont incubées à 37 °C dans 5 % de CO2 pendant 2 heures. Les échantillons des chambres donneuse et réceptrice sont collectés et analysés à la recherche de la présence de l'article testé par LC-MS. Ensuite, on détermine la perméabilité de l'article testé et le taux d'efflux.

Évaluation du substrat : le transport de l'article testé seul ou en présence d'inhibiteurs sélectifs sera déterminé dans les deux sens. Le transport d'un substrat d'investigation pour chaque transporteur seul ou en présence d'inhibiteurs sélectifs sera réalisé comme témoin.

Évaluation de l'inhibiteur : le transport d'un substrat d'investigation sera déterminé dans les deux sens après une incubation de 2 heures, seul ou en présence d'un inhibiteur sélectif ou de l'article testé. En cas d'observation d'une inhibition du transport des efflux, la CI50 peut être déterminée.

  • Système de test : vésicules membranaires (50 µg/puits) exprimant le transporteur d'efflux (ABC) BSEP.
  • Concentrations des articles testés : 2 pour les essais substrats et 2 pour les essais d'inhibition.
  • Mesure de l'activité dépendante de l'adénosine triphosphate (ATP), l'adénosine monophosphate (AMP) étant utilisée comme témoin.
  • Substrat d'investigation radiomarqué spécifique à BSEP
  • Des inhibiteurs de contrôle positifs pour chaque transporteur

Les vésicules membranaires exprimant BSEP et l'article testé ou le substrat d'investigation seront incubés dans des plaques à 96 puits. L'absorption sera amorcée par l'ajout d'adénosine triphosphate (ATP), suivi d'une incubation de 30 minutes à 37 °C. L'adénosine monophosphate (AMP) sera utilisée en parallèle comme témoin négatif. L'absorption sera terminée par une aspiration sous vide et un double rinçage des filtres avec l'excès de solution glacée utilisée pour le transport. Les vésicules sont ensuite extraites des plaques filtrantes pour la quantification LC-MS et le calcul de l'activité dépendant de l'ATP.

Évaluation du substrat : l'absorption de l'article testé seul et avec un inhibiteur sélectif en présence d'ATP sera comparée à l'absorption en présence d'AMP. L'absorption d'un substrat d'investigation par BSEP seul et en présence d'un inhibiteur sélectif sera effectuée comme contrôle.

Évaluation de l'inhibiteur : l'absorption d'un substrat d'investigation sera effectuée seule et en présence d'un inhibiteur sélectif ou de l'article testé ; l'absorption en présence d'ATP sera comparée à l'absorption en présence d'AMP. En cas d'observation d'une inhibition de l'absorption d'ATP dépendante de l'article testé, la CI50 peut être déterminée.

 

Livrables

Ces essais identifieront et profileront les interactions avec le substrat ou d'inhibition avec des transporteurs membranaires. Les données décriront l'étendue de l'absorption ou de l'écoulement, la perméabilité de l'article testé, l'inhibition du transporteur et les valeurs de la CI50 selon le cas.

Ces données peuvent également être utilisées pour évaluer les risques d'interaction médicamenteuse possibles avec les thérapies concomitantes et pour aider à classer les nouveaux médicaments candidats. En cas d'interactions, la pharmacométrie peut apporter des informations supplémentaires au moment d'évaluer le besoin d'essai clinique.