Méthodes
- Système de test : regroupement de microsomes hépatiques humains et d'enzymes humaines recombinantes exprimées individuellement avec les cofacteurs requis
- Isoformes CYP : CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 et CYP3A4. (D'autres CYP, UGT et enzymes du métabolisme des médicaments sont également disponibles).
- Des inhibiteurs chimiques spécifiques aux isoformes et des enzymes recombinantes sont utilisés pour la confirmation.
L'article testé est préincubé pendant au moins 5 minutes avec des microsomes dans un tampon de phosphate. Le métabolisme de l'article testé est déclenché par l'ajout de NADPH ou d'un autre cofacteur approprié. Les incubations sont interrompues en ajoutant un solvant organique, les échantillons sont ensuite analysés pour l'article testé et/ou ses métabolites par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS).
Phase I – Optimisation des conditions d'incubation in vitro
L'article testé est incubé en trois exemplaires avec une gamme de concentrations de microsomes (généralement 0,1 – 1 mg de protéine/ml) pendant quatre intervalles de temps allant jusqu'à 60 minutes en présence de NADPH ou d'un autre cofacteur adapté.
Des incubations de contrôle sont réalisées en l'absence de cofacteur. Les conditions d'incubation de la concentration microsomale et le moment de l'incubation qui produisent un taux linéaire de disparition des articles testés sont utilisés pour définir les expériences de suivi.
Phase II – Analyse cinétique du métabolisme des articles testés
La rapidité avec laquelle l'article testé disparaît est contrôlée dans les échantillons d'incubation avec au moins huit concentrations de l'article testé en trois exemplaires dans des conditions optimisées. Les données sont analysées en utilisant l'ajustement de la courbe de Michaelis-Menten et les paramètres cinétiques Km et Vmax sont déterminés pour l'article testé.
Phase III – Analyse de l'inhibition à l'aide d'inhibiteurs chimiques propres à la CYP
L'article testé est incubé en trois exemplaires, à une concentration <Km, avec des microsomes hépatiques humains regroupés, en l'absence ou en présence des inhibiteurs chimiques à sélectivité enzymatique. Les incubations de contrôle sont effectuées en l'absence de l'inhibiteur uniquement à l'aide du solvant du véhicule.
Phase IV – Métabolisme utilisant des CYP humaines recombinantes
L'article testé est incubé en trois exemplaires à une concentration <Km avec une gamme de CYP et UGT humaines recombinantes, et d'autres enzymes du métabolisme des médicaments (voir ci-dessus). La concentration relative de l'article testé à 0 et 60 minutes est mesurée.
Livrables
Ces dosages permettront d'identifier les enzymes responsables et l'étendue du métabolisme de l'article testé in vitro. La cinétique de la disparition de l'article testé et/ou de la formation de métabolites est déterminée. L'évaluation du métabolisme in vitro identifie les principales enzymes impliquées et vous avertit des risques potentiels liés au mécanisme de clairance in vivo avant les premiers essais sur l'homme.