La technique ddPCR est basée sur la répartition des échantillons d'acide nucléique en dizaines de milliers de microgouttelettes de volume défini dans une émulsion eau-huile. L'amplification des séquences d'acides nucléiques cibles est réalisée dans chaque microgouttelette à l'aide d'un processus et de réactifs similaires à ceux utilisés dans un dosage standard basé sur les sondes TaqMan®. Sur la base de la détection de la fluorescence après l'amplification, chaque gouttelette est comptée et classée comme PCR positive ou PCR négative. La concentration de la matrice ADN/ARN cible (copies/µl) dans l'échantillon original est quantifiée à l'aide d'une distribution de Poisson.1,2
La ddPCR permet de mesurer des quantités absolues de séquences d'acides nucléiques par volume d'échantillon sans extrapolation à partir de courbes standard ou d'étalons de référence. Elle peut détecter de petites variations de taux dans de très faibles volumes d'échantillons qui pourraient ne pas être détectées par la qPCR. Les résultats de la ddPCR sont plus exacts, plus sensibles et plus précis que ceux de la qPCR en raison des milliers de points de données pour chaque échantillon.
La ddPCR peut détecter tous les types de séquences d'ADN ou d'ARN pour lesquels des amorces et des sondes peuvent être construites, comme l'ADNct, l'ADNcf/ARN, l'ARNm, l'ARNr, l'ARNsn, l'ARNsno, l'ARNmi ou l'ARNsi.
Tout échantillon contenant des séquences d'ADN ou d'ARN peut être utilisé pour la ddPCR, comme les lysats cellulaires et tissulaires, les tissus, les liquides biologiques (sang, liquide céphalorachidien, larmes, urine, salive, etc.), les surnageants cellulaires ou les produits synthétiques à base d'acide nucléique.
Comme pour la qPCR, une analyse classique dure environ quatre heures. Le processus d'exécution de la ddPCR nécessite une étape supplémentaire pour créer des dizaines de milliers de microgouttelettes d'huile de la taille d'un nanolitre. Cependant, le temps supplémentaire nécessaire à cette étape est annulé par l'analyse numérique simplifiée du lecteur ddPCR.
Les échantillons constitués d'ADN/ARN extraits/isolés/purifiés peuvent être exécutés et analysés immédiatement avec le système ddPCR QX200 de Bio-Rad. Les surnageants cellulaires et les lysats de cellules/tissus nécessitent une extraction/isolation/purification de l'ADN ou de l'ARN avant que l'analyse ddPCR puisse être effectuée. Pour garantir la sécurité du personnel des laboratoires de Labcorp, les tissus, les liquides biologiques et les surnageants cellulaires devront obligatoirement faire l'objet d'un test de détection des agents pathogènes avant d'être manipulés dans les laboratoires de Labcorp. En outre, toutes les matières d'origine humaine (tissus ou fluides corporels), les micro-organismes ou les virus, les produits créés dans des systèmes biologiques présentant un risque potentiel de contamination biologique et les molécules d'acide nucléique recombinant et/ou synthétique doivent faire l'objet d'un formulaire d'enregistrement de biosécurité et d'une autorisation subséquente par le comité de biosécurité de Labcorp PCO avant la manipulation des matières en question.
Si vous n'extrayez/n'isolez/ne purifiez pas l'ADN/ARN avant d'expédier les échantillons pour la ddPCR, Labcorp PCO recommande de protéger/stabiliser/préserver les acides nucléiques dans les échantillons de cellules et de tissus avec une solution de préservation des acides nucléiques (telle que RNAlater®, DNA/RNA ShieldTM ou RNAprotect®) avant de les congeler et de les expédier.
Tous les échantillons doivent être expédiés congelés dans une boîte isolée avec de la glace sèche.
1. Système QX200 Droplet Digital PCR. BIO-RAD. https://www.bio-rad.com/en-us/life-science/digital-pcr/qx200-droplet-digital-pcr-system.
2. Taylor SC, Laperriere G, Germain H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Sci Rep. 2017;7:2409. doi:10,1/s41598-017-02217-x.
